Genetiske Undersøgelser i Klinik for Vækst og Reproduktion

​Yq MIKRODELETIO​​NSUNDERSØGELSE

(IUPAC-nr: DNK35857)

Bag​gru​​​nd

På Y-kromosomet findes flere gener, der er nødvendige for normal spermatogenese. Dette blev klart allerede i 1976 da store terminale Y-kromosomdeletioner var blevet opsporet ved karyotypeundersøgelse af 6 infertile mænd. På den baggrund blev det foreslået, at der på Y-kromosomets lange arm (Yq11) findes en såkaldt AZoospermisk Faktor (AZF), som er nødvendig for normal sædcelledannelse. Ved hjælp af PCR (Polymerase Chain Reaction) kan man nu påvise små interstitielle deletioner (mikrodeletioner), som ikke kan identificeres ved karyotypeundersøgelse. Mikrodeletionsundersøgelser har ført til, at den oprindelige AZF-regionen er blevet yderligere defineret til at omfatte tre mindre regioner i Yq11 regionen: AZFa, AZFb og AZFc, som alle indeholder gener, der spiller en rolle i kønscellers udvikling, differentiering og meiotiske deling. Komplette AZFa, -b eller -c deletioner er associerede med meget alvorlige defekter i spermatogenesen som fører til azoospermi eller svær oligozoospermi (<5 mill/ml). Der findes dog også partielle AZFc-deletioner (gr/gr- og b2/b3-deletioner) både hos infertile og fertile mænd. Eksakt viden om kliniske konsekvenser af partielle deletioner mangler stadig, men foreløbige resultater peger på, at gr/gr-deletion er en risikofaktor for nedsat spermatogenese, mens b2/b3-deletion betragtes som polymorfi.

An​aly​semetode

Yq-mikrodeletionsundersøgelsen på Klinik for Vækst og Reproduktion omfatter PCR amplifikation af i alt 12 STS markører, som tilsammen dækker de tre AZF regioner:
  • AZFa: DBY, sY84
  • AZFb: sY114, eIF1AY, sY134
  • AZFc: sY152, BPY2, sY254, sY158, sY1197, sY1191, sY1291
Desuden amplificeres SRY, som er lokaliseret til Yp (den korte arm), og ZFY/ZFX, et gen som findes både på Y- og X kromosomet. Som udgangsmateriale anvendes genomisk DNA oprenset fra leukocytter fra en venøs blodprøve. PCR produkterne undersøges med gel-elektroforese. Hver undersøgelse omfatter kontrol-DNA fra hhv. en fertil mand (positiv kontrol) og en kvinde (negativ kontrol), samt en kontrol uden DNA. Såfremt der påvises mikrodeletioner, verificeres resultatet ved gentagelse af analysen i alt tre gange. Sidste gentagelse udføres på DNA fra en ny, uafhængigt opsamlet, blodprøve. Hos alle patienter med mikrodeletioner i AZFc regionen udføres supplerende analyse – vha metoden: kvantitativ PCR for at undersøge antallet af DAZ-gen-kopier. Der findes normalt 4 DAZ-gen-kopier på Y-kromosomet, men, mænd med gr/gr- eller b2/b3-deletioner har kun 2 kopier, mens patienter med komplet AZFc-deletion mangler alle DAZ-kopier. I sjældne tilfælde ses der også komplicerede afvigelser med partielle deletioner eller duplikationer, som kan resultere i 6-8 gen-kopier.​

Kvalite​​tssikring

Klinik for Vækst og Reproduktion er tilmeldt det europæiske kvalitetssikringsprogram for Y-kromosommikrodeletioner "External Quality Assessment Scheme for the Molecular Diagnosis of Y-Chromosomal Microdeletions" (EQAS Y Chromosome), som er en del af "The European Molecular Genetics Quality Network" (EMQN). Programmet omfatter både blindtest af prøver og en evaluering af svarafgivelsen.

Prøvehån​​​​​dtering

Der opsamles en venøs blodprøve (6 ml) i EDTA glas. Prøver kan sendes til Klinik for Vækst og Reproduktion uden nedkøling, såfremt prøven kan være os i hænde inden 3 dage. Længere tids opbevaring (max 7 dage) sker ved opbevaring på køl (4˚C).

Rekvisiti​​on og​ svarangivelse

Skemaer til rekvisition af analysen kan hentes elektronisk her fra siden under prøvetagning og forsendelse eller fås ved henvendelse til Klinik for Vækst og Reproduktions molekylærbiologiske laboratorium, tlf. 3545 5143 (direkte). Udfyldelse af rubrik vedrørende diagnose er vigtig, såfremt man ønsker lægelige kommentarer til resultatet af analysen. Svar tilsendes på særligt svarskema. Svar kan forventes efter 1-1½ uge.

Refe​​renc​er

Tiepolo L and Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the non-fluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet 34:119-124, 1976.
Krausz C, Rajpert-De Meyts E, Frydelund-Larsen L, Quintana-Murci L, McElreavey K, Skakkebæk NE. Double blind screening for microdeletions of Y chromosome genes in infertile and fertile/normospermic Danish men. J Clin Endocrinol Metab 86: 2638-2642, 2000.

Frydelund-Larsen L, Krausz CG, Leffers H, Andersson A-M, Carlsen E, Bangsbøll S, McElreavey K, Skakkebæk NE, Rajpert-De Meyts E. Inhibin B: A marker for the functional state of the seminiferous epithelium in patients with AZFc microdeletions. J Clin Endocrinol Metab 87: 5618–5624, 2002.

Simoni M, Bakker E, Krausz C. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal deletions. State of the art 2004. Int J Androl 27: 240-249, 2004.

Krausz C. Quintana-Murci L , Forti G. Y chromosome polymorphisms in medicine. Ann Med 36: 573-583, 2004.

Mau Kai C, Juul A, McElreavey K, Ottesen AM, Garn ID, Main KM, Loft A, Jørgensen N, Skakkebæk NE, Andersen AN, Rajpert-De Meyts E. Sons conceived by assisted reproduction techniques inherit deletions in the azoospermia factor (AZF) region of the Y-chromosome and the DAZ gene copy number. Hum Reprod 23: 1669-78, 2008.​

AR-qPCR: ANALYSE AF KOPIANTALLET AF ANDROGEN RECEPTOR-GENET (AR) 

(IUPAC-nr: NPU19010)​

Baggr​u​nd

Kvinder har normalt to X-kromosomer (karyotype: 46,XX) mens mænd kun har et enkelt X-kromosom og et Y-kromosom (karyotype: 46,XY). Der er dog flere tilstande, hvor antallet af kønskromosomer er afvigende. Dette ses bl.a. hos mænd med Klinefelter syndrom (47,XXY eller varianter med flere X-kromosomer, f. eks. 48,XXXY) og hos kvinder med Turner syndrom (45,X). Klinefelter syndrom er den hyppigste genetiske afvigelse og findes hos 1 ud af 667 mænd, men sygdommen diagnosticeres kun hos få, fordi der er stor variation i de kliniske symptomer hos forskellige personer. Diagnoserne: Klinefelter og Turner syndrom kan stilles ved konventionel karyotype-bestemmelse på dyrkede blodceller, hvilket dog er en tidskrævende procedure. Vi har derfor udviklet en hurtig og robust screeningsmetode, hvor antallet af X-kromosomer illustreres ved måling af antallet af androgen receptor (AR)-genet, der er lokaliseret til X-kromosomet. Den anvendte analyseteknik kaldes kvantitativ qPCR og unormale resultater kontrolleres efterfølgende vha en anden analyseteknik: fluorescens in situ hybridisering (FISH) med prober specifikke for X- og Y-kromosomer.
AR-qPCR-analysen tænkes anvendt som en hurtig screeningsmetode af patienter fra andrologiske og endokrinologiske klinikker ved mistanke om variationer i antallet af X-kromosomer. Analysen kan med fordel suppleres med SHOX-qPCR-analysen. For udførlig diagnose kræves dog en konventionel karyotype-bestemmelse, der udføres på Klinisk Genetisk Klinik.​

Analy​​se​metode

Analysemetoden består af en kvantitativ (real-time)-PCR opformeringsteknik. Opformeringen sker i den pågældende prøve af en del af AR-genets DNA-sekvens på X-kromosomet og samtidig af et reference-gen (til sammenligning) på et andet kromosom. Herefter beregnes en relativ værdi (ratio) mellem resultaterne fra de to gener, som illustrerer kopiantallet af AR-gener dvs antallet af X-kromosomer. Hvis ratio-værdien tyder på et unormalt antal X-kromosomer kontrolleres fundet vha en FISH-analyse med centromerprober specifikke for X- og Y-kromosomet på celler fra den samme blodprøve.

Prøveh​​ån​​dtering

Analysen udføres på genomisk DNA oprenset fra blod. En prøve (6 ml) fra perifert veneblod opsamles i et prøverør med EDTA og kan sendes til Klinik for Vækst og Reproduktion uden nedkøling såfremt prøven kan være os i hænde indenfor 3 dage. I modsat fald kan prøven opbevares (max 7 dage) på køl (v/4oC) og herefter sendes.
Rekvisition og analysesvar
Skema til bestilling af analysen kan hentes elektronisk her fra siden under linket: prøvetagning og forsendelse eller fås ved henvendelse til Klinik for Vækst og Reproduktions molekylærbiologiske laboratorium, tlf. 3545 5143. Udfyldelse af rubrik vedr. diagnose er vigtig, såfremt man ønsker en lægelig kommentar til resultatet af analysen. Svar tilsendes på særligt svarskema og kan forventes efter 7-10 dage.

Refere​​​n​cer

Bojesen A, Juul S, Gravholt CH. Prenatal and postnatal prevalence of Klinefelter syndrome: a national registry study. J Clin Endocrinol Metab 88: 622-626, 2003
Ottesen AM, Garn ID, Aksglæde L, Juul A, Rajpert-De Meyts E. A simple screening method for detection of Klinefelter syndrome and other X-chromosome aneuploidies based on the copy number of the androgen receptor gene. Mol Hum Reprod: 13: 745-750, 2007.

SHOX-qPCR: ANALYSE AF KOPIANTALLET AF SHORT STATURE HOMEOBOX-CONTAINING-GENET (SHOX)

(IUPAC-nr: NPU39974)​

Bagg​​rund

SHOX-genet sidder på X- og Y-kromosomet, i PAR1-regionen, som ikke inaktiveres, hvorfor både kvinder og mænd udtrykker de to udgaver af genet. En mutation i SHOX på det ene kønskromosom medfører Leri-Weill syndrom, som er kendetegnet ved ringe højdevækst og evt specifikke skelet-abnormiteter (Madelungs deformitet, kort 4. metacarpal og mikrognathisme). Ligeledes er højden nedsat hos individer med SHOX-haploinsufficiens som f.eks. Turner syndrom (45,X). Derimod bliver individer med 47,XXY Klinefelter syndrom højere end normalt ligesom mænd med 47,XYY og kvinder med 47,XXX, hvilket antages at være forårsaget af aktiviteten af et forøget antal SHOX-kopier. Et nyt studie har dog vist en non-lineær sammenhæng mellem antallet af SHOX-gener og sluthøjden hos individer med forskellige antal kønskromosomer. Forekomsten af mutationer eller deletion af hele SHOX-genet er beskrevet hos 2-15% af patienter med idiopatisk short stature (ISS), hvoraf SHOX-deletioner udgør ca halvdelen.
Vi har udviklet en hurtig og robust teknik: kvantitativ PCR (qPCR) til måling af kopiantallet af SHOX-genet (f.eks. 1 SHOX kopi hos 45,X, 2 SHOX-kopier hos 46,XX og 46,XY, 3 SHOX-kopier hos 47,XXY) . SHOX-qPCR-analysen anvendes primært til screening for SHOX-haploinsufficiens hos ISS patienter, men kan således ikke anvendes til påvisning af punktmutationer i SHOX-genet. Analysen kan anvendes som supplement til AR-qPCR analysen (se side 31) hos patienter mistænkt for Klinefelter eller Turner syndrom.​

Analyse​​metode

Analysemetoden består af en kvantitativ (real-time)-PCR opformeringsteknik. Opformeringen sker i den pågældende prøve af en del af SHOX-genets DNA-sekvens på X- og Y-kromosomet og samtidig af et reference-gen (til sammenligning) på et andet kromosom. Der beregnes en relativ værdi (ratio) mellem resultaterne fra de to gener, som illustrerer kopiantallet af SHOX-gener. Et unormalt/uforventet SHOX-resultat kontrolleres vha analyseteknikken: fluorescens in situ hybridisering (FISH) med en specifik probe for SHOX-genet.

Prøvehå​​n​​dtering

Analysen udføres på genomisk DNA oprenset fra blod. En prøve (6ml) fra perifert veneblod opsamles i et prøverør med EDTA og sendes til Klinik for Vækst og Reproduktion uden nedkøling såfremt prøven kan være os i hænde indenfor 3 dage. I modsat fald kan prøven opbevares (max 7 dage) på køl (v/4oC) og herefter sendes.

Rekvisition​​​ og ​​​analysesvar

Skema til bestilling af analysen kan hentes elektronisk her på siden eller fås ved henvendelse til Klinik​ for Vækst og Reproduktions molekylærbiologiske laboratorium, tlf. 3545 5143. Udfyldelse af rubr​ik vedr. diagnose er vigtig, såfremt man ønsker en lægelig kommentar til resultatet af analysen. Svar tilsendes på særligt svarskema og kan forventes efter 7-10 dage.

Re​fe​​r​​encer

Leka SK, Kitsiou-Tzeli S, Kalpini-Mavrou A & Kanavakis E. Short stature and dysmorphology associated with defects in the SHOX gene. Hormones (Athens) 5:107-18, 2006.
Belin V, Cusin V, Viot G, Girlich D, Toutain A, Moncla A, Vekemans M, Le Merrer M, Munnich A & Cormier-​Daire V. SHOX mutations in dyschondrosteosis (Leri-Weill syndrome). Nat. Genet. 19:67-69, 1998.

​Aksglaede L, Skakkebaek NE & Juul A. Abnormal Sex Chromosome Constitution and Longitudinal Growth: Serum Levels of Insulin-Like Growth Factor (IGF)-I, IGF Binding Protein-3, Luteinizing Hormone, and Testosterone in 109 Males with 47,XXY, 47,XYY, or Sex-Determining Region of the Y Chromosome (SRY)-Positive 46,XX Karyotypes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 93:169-176, 2008.

Ogata T, Matsuo N & Nishimura G. SHOX haploinsufficiency and overdosage: impact of gonadal function status. J. Med. Genet. 38:1-6, 2001.

Thomas NS, Harvey JF, Bunyan DJ, Rankin J, Grigelioniene G, Bruno DL, Tan TY, Tomkins S & Hastings R. Clinical and molecular characterization of duplications encompassing the human SHOX gene reveal a variable effect on stature. Am. J. Med. Genet. A 149A:1407-1414, 2009.

*Ottesen AM, *Aksglaede L, Garn I, Tartaglia N, Tassone F, Gravholt CH, Bojesen A, Sørensen K, Jørgensen N, Rajpert–De Meyts E, Gerdes T, Lind A-M, Kjaergaard S, Juul A. Increased Copy Number of the SHOX Gene Affects Height in a Non-Linear Fashion.*The two first authors contributed equally. (Submitted for publication.)

Ottesen AM, Garn ID, Aksglæde L, Juul A, Rajpert-De Meyts E. A simple screening method for detection of Klinefelter syndrome and other X-chromosome aneuploidies based on the copy number of the androgen receptor gene. Mol. Hum. Reprod. 13: 745-50, 2007.​


Redaktør