Genetiske Undersøgelser i Klinik for Vækst og Reproduktion

​Yq MIKRODELETIO​​NSUNDERSØGELSE

(IUPAC-nr: DNK35857)

Bag​gru​​​nd

På Y-kromosomet findes flere gener, der er nødvendige for normal spermatogenese. Dette blev klart allerede i 1976 da store terminale Y-kromosomdeletioner var blevet opsporet ved karyotypeundersøgelse af 6 infertile mænd. På den baggrund blev det foreslået, at der på Y-kromosomets lange arm (Yq11) findes en såkaldt AZoospermisk Faktor (AZF), som er nødvendig for normal sædcelledannelse. Ved hjælp af PCR (Polymerase Chain Reaction) kan man nu påvise små interstitielle deletioner (mikrodeletioner), som ikke kan identificeres ved karyotypeundersøgelse. Mikrodeletionsundersøgelser har ført til, at den oprindelige AZF-regionen er blevet yderligere defineret til at omfatte tre mindre regioner i Yq11 regionen: AZFa, AZFb og AZFc, som alle indeholder gener, der spiller en rolle i kønscellers udvikling, differentiering og meiotiske deling. Komplette AZFa, -b eller -c deletioner er associerede med meget alvorlige defekter i spermatogenesen som fører til azoospermi eller svær oligozoospermi (<5 mill/ml). Der findes dog også partielle AZFc-deletioner (gr/gr- og b2/b3-deletioner) både hos infertile og fertile mænd. Eksakt viden om kliniske konsekvenser af partielle deletioner mangler stadig, men foreløbige resultater peger på, at gr/gr-deletion er en risikofaktor for nedsat spermatogenese, mens b2/b3-deletion betragtes som polymorfi.

An​aly​semetode

Yq-mikrodeletionsundersøgelsen på Klinik for Vækst og Reproduktion omfatter PCR amplifikation af i alt 12 STS markører, som tilsammen dækker de tre AZF regioner:
  • AZFa: DBY, sY84
  • AZFb: sY114, eIF1AY, sY134
  • AZFc: sY152, BPY2, sY254, sY158, sY1197, sY1191, sY1291
Desuden amplificeres SRY, som er lokaliseret til Yp (den korte arm), og ZFY/ZFX, et gen som findes både på Y- og X kromosomet. Som udgangsmateriale anvendes genomisk DNA oprenset fra leukocytter fra en venøs blodprøve. PCR produkterne undersøges med gel-elektroforese. Hver undersøgelse omfatter kontrol-DNA fra hhv. en fertil mand (positiv kontrol) og en kvinde (negativ kontrol), samt en kontrol uden DNA. Såfremt der påvises mikrodeletioner, verificeres resultatet ved gentagelse af analysen i alt tre gange. Sidste gentagelse udføres på DNA fra en ny, uafhængigt opsamlet, blodprøve. Hos alle patienter med mikrodeletioner i AZFc regionen udføres supplerende analyse – vha metoden: kvantitativ PCR for at undersøge antallet af DAZ-gen-kopier. Der findes normalt 4 DAZ-gen-kopier på Y-kromosomet, men, mænd med gr/gr- eller b2/b3-deletioner har kun 2 kopier, mens patienter med komplet AZFc-deletion mangler alle DAZ-kopier. I sjældne tilfælde ses der også komplicerede afvigelser med partielle deletioner eller duplikationer, som kan resultere i 6-8 gen-kopier.​

Kvalite​​tssikring

Klinik for Vækst og Reproduktion er tilmeldt det europæiske kvalitetssikringsprogram for Y-kromosommikrodeletioner "External Quality Assessment Scheme for the Molecular Diagnosis of Y-Chromosomal Microdeletions" (EQAS Y Chromosome), som er en del af "The European Molecular Genetics Quality Network" (EMQN). Programmet omfatter både blindtest af prøver og en evaluering af svarafgivelsen. Analysen er desuden godkendt af DANAK.

Prøvehån​​​​​dtering

Der opsamles en venøs blodprøve (6 ml) i EDTA glas. Prøver kan sendes til Klinik for Vækst og Reproduktion uden nedkøling, såfremt prøven kan være os i hænde inden 3 dage. Længere tids opbevaring (max 7 dage) sker ved opbevaring på køl (4˚C).

Rekvisiti​​on og​ svarangivelse

Skemaer til rekvisition af analysen kan hentes elektronisk her fra siden under prøvetagning og forsendelse eller fås ved henvendelse til Klinik for Vækst og Reproduktions molekylærbiologiske laboratorium, tlf. 3545 5143 (direkte). Udfyldelse af rubrik vedrørende diagnose er vigtig, såfremt man ønsker lægelige kommentarer til resultatet af analysen. Svar tilsendes på særligt svarskema. Svar kan forventes efter 1 måned.

Refe​​renc​er

Tiepolo L and Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the non-fluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet 34:119-124, 1976.
Krausz C, Rajpert-De Meyts E, Frydelund-Larsen L, Quintana-Murci L, McElreavey K, Skakkebæk NE. Double blind screening for microdeletions of Y chromosome genes in infertile and fertile/normospermic Danish men. J Clin Endocrinol Metab 86: 2638-2642, 2000.

Frydelund-Larsen L, Krausz CG, Leffers H, Andersson A-M, Carlsen E, Bangsbøll S, McElreavey K, Skakkebæk NE, Rajpert-De Meyts E. Inhibin B: A marker for the functional state of the seminiferous epithelium in patients with AZFc microdeletions. J Clin Endocrinol Metab 87: 5618–5624, 2002.

Simoni M, Bakker E, Krausz C. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal deletions. State of the art 2004. Int J Androl 27: 240-249, 2004.

Krausz C. Quintana-Murci L , Forti G. Y chromosome polymorphisms in medicine. Ann Med 36: 573-583, 2004.

Mau Kai C, Juul A, McElreavey K, Ottesen AM, Garn ID, Main KM, Loft A, Jørgensen N, Skakkebæk NE, Andersen AN, Rajpert-De Meyts E. Sons conceived by assisted reproduction techniques inherit deletions in the azoospermia factor (AZF) region of the Y-chromosome and the DAZ gene copy number. Hum Reprod 23: 1669-78, 2008.​

Genetiske polymorfi-analyse af FSHB og FSHR i Klinik for Vækst og Reproduktion

Genetisk polymorfi-analyse af FSHB og FSHR

(IUPAC-nr: NPU57373 (DNAFSH211), NPU57374 (DNAFSH29) og NPU57375 (DNAFSH2039))

Baggrund

En enkelt-nukleotid-polymorfi (SNP, single nucleotide polymorphism) henviser til variationer (også kaldet polymofier) i individers DNA. Et eksempel er genet FSHB som koder for beta-subunit af FSH (follikelstimulerende hormon). En SNP, som findes 211 baser opstrøms for transkriptionsstart (rs10835638), har vist sig at have en effekt på FSH-niveauer hos begge køn. Polymorfien forårsager, at transkriptionen ikke er lige så effektivt, og at der derfor produceres mindre FSH. 
Et andet eksempel er en SNP, som findes som nr. 2039 i den kodende region for FSH-receptoren (FSHR). Denne SNP forårsager, at FSH-receptoren ikke virker lige så godt og at der derfor skal mere FSH til for at stimulere cellerne. Dette har vist sig at have en effekt på FSH-niveauer både hos mænd og kvinder og deraf afledte kliniske tegn som bl.a. senere pubertet og dårligere sædkvalitet (Tüttelmann et al. 2012, Hagen et al., 2013 og 2014).

Analysemetode

Analyse af ovennævnte tre SNPs (rs10835638, rs1394205 og rs6166) detekteres ved hjælp af et assay, som kaldes Kompetitive Allele Specific PCR (KASP). KASP er en fluorescens-baseret, kompetitiv genotyperingsteknik, som er baseret på allel-specifikke primere og inkorporering af en fluorescerende kilde, hvis energi detekteres som et signal.

Kvalitetssikring

Klinik for Vækst og Reproduktion udfører årlig ekstern kvalitetskontrol hvor prøver blindt analyseres i et uafhængigt laboratorie med samme teknik. Analysen er godkendt af DANAK.

Prøvehåndtering

Der opsamles en venøs blodprøve (6 ml) i EDTA glas. Prøver kan sendes til Klinik for Vækst og Reproduktion uden nedkøling, såfremt prøven kan være os i hænde inden 3 dage. Længere tids opbevaring (max 7 dage) sker ved opbevaring på køl (4˚C).

Rekvisition og svarangivelse

Skemaer til rekvisition af analysen kan hentes elektronisk her fra siden under prøvetagning og forsendelse eller fås ved henvendelse til Klinik for Vækst og Reproduktions molekylærbiologiske laboratorium, tlf. 3545 5143 (direkte). Udfyldelse af rubrik vedrørende diagnose er vigtig, såfremt man ønsker lægelige kommentarer til resultatet af analysen. Svar tilsendes på særligt svarskema. Svar kan forventes efter 1 måned.

Referencer

Hagen CP, Aksglaede L, Sørensen K, Mouritsen A, Mieritz MG, Main KM, Petersen JH, Almstrup K, Rajpert-De Meyts E, Anderson RA, Juul A. FSHB-211 and FSHR 2039 are associated with serum levels of follicle-stimulating hormone and antimüllerian hormone in healthy girls: a longitudinal cohort study. Fertil Steril. 2013 Oct;100(4):1089-95. 

Hagen CP, Sørensen K, Aksglaede L, Mouritsen A, Mieritz MG, Tinggaard J, Wohlfart-Veje C, Petersen JH, Main KM, Rajpert-De Meyts E, Almstrup K, Juul A. Pubertal onset in girls is strongly influenced by genetic variation affecting FSH action. Sci Rep. 2014 Sep 18;4:6412. 

Tüttelmann F, Laan M, Grigorova M, Punab M, Sõber S, Gromoll J. Combined effects of the variants FSHB -211G>T and FSHR 2039A>G on male reproductive parameters. J Clin Endocrinol Metab. 2012 Oct;97(10):3639-47.



Redaktør