In vivo karakterisering af Pseudomonas aeruginosa lungeinfektion hos patienter med cystisk fibrose (CF)

Vi har undersøgt, hvordan bakterien Pseudomonas aeruginosa opfører sig i sit naturlige miljø i CF-patienters lunge. Der viser sig store forskelle fra laboratorieforsøg.

I Danmark er der næsten 500 patienter, som har CF. Sygdommen skyldes en ændring i CF transmembran konduktansregulatorproteinet (CFTR), der fører til en defekt kloridkanal og dermed ophobning af sejt slim i lungerne, som sammen med en nedsat mucociliær clearance fører til øget modtagelighed for bakterielle infektioner. Pseudomonas aeruginosa (PA) er den vigtigste bakterie, som inficerer CF-patienternes lunger og fører til øget sygelighed, nedsat livskvalitet og tidlig død. Når CF-patienterne skal have deres PA-infektioner behandlet, indlægges de til intravenøs (IV) antibiotikabehandling. Antibiotika reducerer bakteriemængden i patienternes lunger, men det er ofte ikke muligt fuldstændigt at udrydde dem.

Vores hypotese er, at infektionen og svigt af antibiotikabehandlingen er komplekse og indbyrdes relaterede fænomener, som er bestemt af bakteriernes fysiologi, når de udsættes for antibiotika (in vivo). Den forskning, der findes på området, har tendens til at overse disse komplekse forhold, som også inkluderer antibiotikaresistens, da undersøgelserne ikke udføres under relevante fysiologiske forhold men under laboratoriebetingelser. Dette kan være én af forklaringerne på, at antibiotikabehandlingen nogle gange kan svigte.

Figur 1. Oversigt over projektet og de vigtigste resultater. (a) Sputumprøver opsamles fra CF-patienterne og herfra isoleres totalt RNA, som sekventeres (in vivo). Fra den samme sputumprøve isoleres efter dyrkning repræsentative P. aeruginosa kolonier, som vi kan undersøge for genekspression under laboratorieforhold (in vitro). (b) Figuren viser genomaflæsning og gruppering af P. aeruginosa ud fra deres transkriptionelle profiler. Bakterierne grupperer sig afhængigt af deres vækstbetingelser (enten lunger eller laboratorium), og man kan se, at P. aeruginosa fysiologi i lungerne er vidt forskellig fra den, man ser under laboratoriebetingelser, som er det, vi plejer at benytte, når vi laver forsøg.

Vores formål og metode

I vores projekt har vi undersøgt PA’s fysiologi i deres naturlige miljø i CF-patienternes lunger. Vi har udviklet en ny metode baseret på sekventering af totalt RNA oprenset direkte fra patienternes sputum (figur 1a). Med denne teknik har vi løst de problemer, der ellers kan være, når man kun kan undersøge bakterierne under laboratoriebetingelser eller i dyremodeller. I frisk sputum har vi undersøgt transkriptionsprofilerne af alle cellerne i sputumprøver. Fra samme sputumprøve har vi dyrket og isoleret PA-kloner og undersøgt deres transkriptionsprofil under de betingelser, som vi plejer at benytte i laboratoriet.

Vores fund

Ved sammenligning af PA’s transkriptionsprofiler i lungerne og under laboratoriebetingelser så vi, at PA’s fænotyper var vidt forskellige, afhængigt af det miljø bakterierne blev undersøgt i (figur 1a). Vores konklusion er derfor, at laboratorieforsøg ikke afspejler virkeligheden i tilstrækkelig grad. Endvidere så vi, at selvom sputumprøver blev indsamlet fra forskellige CF-patienter, kunne vi alligevel se ens transkriptionsmønstre, (figur 1a). Disse resultater tyder på, at trods forskelle i bakteriernes genetiske baggrund og i patienternes lungemiljø kan infektionen beskrives generisk ud fra genekspressionsmønstre eller specifikke markører. På sigt håber vi, at disse kan benyttes til at følge sygdommens udvikling, og måske kan vi identificere områder, hvor vi kan forbedre behandlingen. Resultaterne af vores projekt er netop blevet offentliggjort i Nature Communications1.

Fremtidige undersøgelser i dette projekt

I de kommende to år vil vi med støtte fra Novo Nordisk Fonden videreudvikle projektet, således at vi både undersøger bakteriernes opførsel under indflydelse af patienterne immunsystem lokalt og systemisk og vice versa. Vi vil undersøge værtsimmunsvaret både i en tværsnitsundersøgelse og en longitudinal undersøgelse.  Vi vil inkludere forskellige aldersgrupper og grupper af CF-patienter, som er i forskellige stadier af deres PA lungeinfektion og se, om der er forskellige reaktioner på antibiotikabehandlingen.  Værtsimmunsystemets svar lokalt og systemisk vil blive undersøgt ved hjælp af en kombination af transkriptomundersøgelser og TruCulture®, som er et immunologisk assay, der kan anvendes på både sputum og blod. Med disse metoder kan vi undersøge de komplekse reaktioner, der foregår mellem værten og bakterierne i et så naturtro system som muligt. Vi forventer også at få endnu mere viden om hvilke mekanismer, der forhindrer en effektiv udryddelse af PA fra CF-patienternes lunger. Projektet laves sammen med overlæge Sisse Rye Ostrowski fra Klinisk Immunologisk Afdeling.

Publikation

1. Rossi, E., Falcone, M., Molin, S. & Johansen, H.K. High-resolution in situ transcriptomics of Pseudomonas aeruginosa unveils genotype independent patho-phenotypes in cystic fibrosis lungs. Nat Commun 9, 3459 (2018).


Redaktør