Helgenomsekventering som diagnostisk værktøj på KMA

Via midler fra Regionen er genomsekventering (WGS) af multiresistente bakterier blevet etableret som et diagnostisk redskab, og en fælles database til deling af data er påbegyndt mhp. bedre smitte- og udbrudssporing.

v/ Karen Leth Nielsen og Rasmus Marvig​​

Helgenomsekventering er i 2016 blevet et diagnostisk redskab på KMA. Regionen har bevilget penge til KMA på Rigshospitalet, Herlev og Hvidovre til at etablere genomsekventering (WGS) af multiresistente bakterier som diagnostisk redskab samt til etablering af en fælles database til deling af data i regionen og senere på landsplan for på den måde bedre at kunne lave smitte og udbrudssporing.

Dette inkluderer udover multiresistente bakterier også udbrudsstammer, eksempelvis vancomycin-resistente enterokokker (VRE). For VRE findes der ikke andre typningsmetoder end WGS, som med sikkerhed kan sige om to isolater fra to patienter er tæt beslægtede og dermed formentlig tilhører samme udbrud. 

Derudover er der i afdelingen etableret diagnostik af isolater fra cystisk fibrose patienter (bl.a. Pseudomonas aeruginosa, Achromobacter spp. og Burkholderia spp.) baseret på WGS for at forbedre behandling af denne patientgruppe. Hvis en patient er persisterende inficeret med samme klontype af fx P. aeruginosa, kan det betyde, at der skal en særlig antibiotikabehandling til for at komme af med infektionen, og at man måske også skal operere patientens bihuler for at se, om det er muligt at fjerne et bakterielt fokus. Omvendt, hvis patienten ikke er kronisk inficeret, men løbende bliver inficeret med forskellige klontyper, kan man måske nøjes med en mindre intensiv antibiotikabehandling. Genomsekventering kan stille en præcis artsdiagnose i forhold til de diagnostiske muligheder, vi har til rådighed i dag, og den kan også med sikkerhed sige, om der er foregået smitte mellem patienter. 

I etableringen af hel-genomsekventering har KMA indledt et samarbejde med Enhed for Genomisk Medicin (GM) på Rigshospitalet, som har erfaring med sekventering af humane prøver samt det nødvendige apparatur. I 2016 er der ved et tæt samarbejde mellem KMA og GM arbejdet med at få metoden sat op til rutinebrug samt at etablere et workflow til den efterfølgende bioinformatiske analyse af sekvensdata. 

Metoden indebærer (1) oprensning af genomisk DNA fra bakteriekolonier på agarplade, (2) fragmentering og amplifikation af DNA biblioteker samt (3) sekventering på Illumina Miseq maskiner. Indledningsvist oprenses DNA fra en renstrøget bakterie vha. DNeasy Blood and Tissue kit fra Qiagen, hvorved det totale DNA oprenses. Renstrygningen er vigtig, da DNA sekvenser fra forskellige kloner ellers vil blive sammenblandet. 

Herefter skal der laves biblioteker; genomisk DNA fragmenteres og samtidig påsættes DNA adaptersekvenser, som tillader amplifikation og sekventering af DNA biblioteket. Disse sekvenser gør, at DNA’et kan binde til overfladen af en flowcelle i Miseq sekventeringsmaskinen. Desuden indeholder hver adaptersekvens en stregkode, så man ved, hvilket isolat det sekventerede DNA stammer fra (der køres 14-20 prøver på samme flowcelle). For at få gode sekvenser for alle isolater i samme kørsel kvantificeres mængden af bibliotek, så disse kan blandes i det rigtige forhold afhængigt af genomets størrelse før kørsel på Miseq; et lille genom kræver mindre bibliotek end et stort genom. Prøverne blandes så sammen og køres på Miseq, og maskinen sorterer data baseret på adaptersekvenserne i enden af DNA´et. Resultatet er aflæsninger af millioner af korte DNA stykker fra hver af de kørte bakterier.

Herefter starter den bioinformatiske analyse. Genomerne skal samles (assembles), så alle de små DNA læsninger sammensættes til større contigs (typisk 200 contigs for E. coli, som har et genom på ca. 5,5 millioner basepar). Herefter identificeres genindhold, og generne navngives (annoteres). Derudover laver vi et tjek af specien for at sikre, at det faktisk er en E. coli og ikke en anden bakterie. 

Analyse af genomer er mere krævende end analyse af mere konventionelle typningsmetoder, eksempelvis MLST, men efterhånden som teknologien udvikles, bliver dette simplificeret i form af relevant software. Den videre analyse foregår ofte ved at bygge et fylogenetisk træ. Herved kigges efter mutationer i de gener, som er til fælles for en gruppe isolater fra samme species, som ønskes sammenlignet. Dette vil ofte være analyse af flere tusinde gener, hvor eksempelvis klassisk MLST typning inkluderede variationer i 7 gener. Genomsekventering er dermed meget præcist i stand til at diskriminere imellem forskellige typer og undertyper af bakterier. Den videre analyse kan inkludere identifikation af resistensgener, indhold af bakteriofager, plasmidindhold, og genomdata kan også anvendes til at finde MLST typen og serotypen. På den måde bygges bro imellem den nye og ældre typningsmetoder.

Vi har i 2016 helgenomsekventeret 460 bakterisolater. Heraf er 313 sekventeret siden 1. september, hvor vi startede med faste ugentlige sekventeringskørsler. Størstedelen af de sekventerede isolater er P. aeruginosa, E. coli, A. xylosoxidans, E. faecium, Burkholderia spp. og A. baumannii. I 2017 vil vi forsætte med at sekventere bakterieisolater på ugentlig basis og forventer således at sekventere 800-1000 isolater. 


Figur 1: Fylogenetisk træ baseret på helgenomsekventering af 90 E. coli isolater fra Rigshospitalet. Grupperingerne i træet er i mange tilfælde i overensstemmelse med ribotypning af de samme isolater. Samtidig ses det, hvorledes helgenomsekventeringen er i stand til at underopdele en gruppe af isolater som alle har samme ribotype.

Tryk på figuren for at se den i fuld størrelse.



Figur 2
Tryk på figuren for at se den i fuld størrelse.


Redaktør